塞利尼索Selinexor通过下调 HLA-E增强 NK 细胞对恶性 B 细胞的激活

塞利尼索Selinexor 是 FDA 批准的核输出蛋白 exportin-1 (XPO1) 的选择性抑制剂，可通过以下途径导致特定的癌细胞死亡肿瘤抑制蛋白的核积累。对 selinexor 与其他治疗药物（如免疫疗法）联合使用的合理研究设计需要对 selinexor 对免疫系统的影响有基本的了解。免疫疗法的一个重要新兴领域是基于自然杀伤 (NK) 细胞的疗法。NK 细胞功能受到来自多种激活和抑制受体的信号平衡的严格调节。因此，在癌症中，激活受体识别的应激配体的上调或抑制性受体识别的 HLA I 类的下调可导致抗癌 NK 细胞反应。因此，XPO1 功能的变化有可能通过改变这种平衡来影响 NK 细胞功能。因此，我们试图研究 selinexor 如何影响 NK 细胞功能。Selinexor 预处理淋巴瘤细胞显着增加了 NK 细胞介导的针对 SU-DHL-4、JeKo-1 和 Ramos 细胞的细胞毒性，同时增加了 NK 细胞上的 CD107a 和 IFNγ 表达。此外，selinexor 增强了抗 CD20 抗体 rituximab 和 obinutuzumab 包被的淋巴瘤细胞的 ADCC。在探索可能的机制时，我们发现 XPO1 抑制显着降低了 HLA-E 在淋巴瘤细胞系和原发性慢性淋巴细胞白血病细胞上的表面表达。HLA-E 结合抑制性受体 NKG2A，据此，selinexor 选择性地增加 NKG2A+ NK 细胞的活化。

自然杀伤 (NK) 细胞是先天免疫效应物，可诱导针对肿瘤细胞的直接细胞毒性并介导抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)。NK 细胞功能和数量的缺乏与癌症的发展增加有关。NK 细胞在肿瘤内的浸润与许多癌症的预后改善有关，而 NK 细胞也与抗 PD-1 抗体治疗期间的存活率有关。在接受基于抗 CD20 的化学免疫治疗的非霍奇金淋巴瘤患者中，NK 细胞数量少与无进展生存期较短相关。除了直接的细胞溶解功能外，NK 细胞还通过释放肿瘤抗原、招募和成熟树突状细胞以及 IFNγ 介导的 MHC I 表达上调来促进最佳 CD8+ T 细胞反应。此外，最近还显示 NK 细胞产生的 IFNγ 可维持肝转移的休眠。

与 T 和 B 淋巴细胞相比，NK 细胞对恶性细胞的激活通过整合来自一系列种系编码的、非重排的表面受体的信号而受到严格控制。抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体 (KIR) 家族和 NKG2A 可检测靶细胞上 HLA 分子的下调，NKG2A 可特异性检测 HLA-E，从而导致抑制作用丧失和 NK 细胞活化。相反，细胞应激相关配体的上调由 NK 细胞表达的多种激活受体检测，包括 NKp30、NKp44、NKp46 和 NKG2D。此外，NK 细胞表达其他激活受体，包括 CD16、NKG2C 以及激活 KIR。由于其强大的抗肿瘤功能，增强 NK 细胞对癌症的活性是目前多种治疗策略的重点。这些包括基于 CAR-NK 的方法 、激动性抗体 、细胞因子介导的刺激 和检查点抑制剂。除了这些直接方法之外，NK 细胞还可以通过检测应激肿瘤细胞上改变的激活和抑制配体表达模式来促进其他癌症疗法的功效。例如，据报道，在肿瘤暴露于细胞抑制药物组合、蛋白酶体抑制剂、遗传毒性剂  和电离辐射 后，NK 细胞活化会增强。
Exportin-1 (XPO1) 是一种核输出蛋白，可将具有富含亮氨酸的核输出信号 (NES) 和核糖体亚基的货物蛋白从细胞核转运至细胞质。这种活动确保实现蛋白质的正确细胞定位，并且对于正常的细胞翻译活动和功能至关重要。XPO1 的上调在人类癌症中很常见，并导致异常的肿瘤抑制蛋白输出，失衡有利于原癌基因活性。XPO1 表达增加与各种癌症的存活率呈负相关，包括弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL) 和套细胞淋巴瘤）。选择性抑制剂 selinexor 对 XPO1 的靶向抑制通过肿瘤抑制蛋白在细胞核中的积累、生长调节蛋白的失调和癌基因蛋白翻译的阻断导致癌细胞死亡 。此外，selinexor 在蛋白酶体依赖性机制中导致 XPO1 蛋白降解。XPO1抑制对患者的治疗效果导致美国FDA批准selinexor用于治疗多发性骨髓瘤和DLBCL患者，并获得欧盟委员会对多发性骨髓瘤患者的有条件上市许可。各种临床试验也在进行中，以评估 selinexor 治疗实体瘤和血液系统恶性肿瘤，包括联合抗 CD20 抗体治疗晚期 B 细胞非霍奇金淋巴瘤 (NCT03147885) 。除了对肿瘤细胞的直接细胞毒性外，selinexor 还被描述为与 TRAIL-R2xCD3 双特异性抗体 联合使用，使乳腺癌细胞对 T 细胞攻击敏感，并增加 CAR T 细胞对 CD19 阳性恶性 B 细胞的活性。然而，selinexor 或 XPO1 抑制对癌细胞对 NK 细胞活性敏感性的影响之前尚未研究过。
Selinexor 增强 NK 细胞对淋巴瘤细胞系的细胞毒性
为了评估 selinexor 是否调节 NK 细胞对恶性 B 细胞的活化，我们将 selinexor (50-2000 nM) 与 SUDHL4 (DLBCL)、JeKo-1 (套细胞淋巴瘤) 或 RAMOS (伯基特淋巴瘤) 细胞一起培养 16 小时，然后评估细胞毒性与从健康人类供体分离的 NK 细胞共培养后。Selinexor 以浓度依赖性方式增加 NK 细胞对 SUDHL4 (p<0.005)、JeKo-1 (p<0.005) 和 RAMOS (p<0.01) 细胞的细胞毒性（图 1A、B）。这种裂解对 NK 细胞活性具有特异性，因为在这些实验中，通过添加半胱天冬酶抑制剂 QVD 可以防止由 selinexor 诱导的细胞凋亡，如碘化丙啶染色没有增加所示（图 1A，B) 在没有 NK 细胞的情况下。这些结果表明，阻断淋巴瘤细胞中的内在细胞凋亡，从而抵抗直接的 selinexor 毒性，并不能阻止由 selinexor 刺激的 NK 介导的裂解。这与先前关于由效应淋巴细胞和纯化的粒酶 B 诱导的不依赖半胱天冬酶的细胞死亡的报道一致。Selinexor 活性通过明显的浓度依赖性 XPO1 降解得到证实（图 1C），如先前报道的。根据我们对 selinexor 增强 NK 细胞对淋巴瘤细胞的活性的观察，我们测量了 CD56 dim和 CD56 Bright 的脱粒 ( CD107a )与这些靶细胞共培养时的 NK 细胞亚群。这表明与未处理的对照相比，selinexor 显着增加了更成熟和具有细胞毒性的 CD56 dim NK 细胞群对所有测试细胞系的脱粒（图 1D，E）。selinexor针对 SUDHL4 细胞显着增强了调节性和增殖性更强的 CD56明亮亚组 NK 细胞的脱粒（图 1E）。这些数据一起表明 XPO1 抑制剂 selinexor 增加了 NK 细胞对 B 淋巴瘤细胞系的细胞毒性。

图 1Selinexor 增加 NK 细胞对淋巴瘤细胞的细胞毒性。(A, B)用 IL-15 孵育过夜的分离的 NK 细胞与 SUDHL4 共培养 4 小时，n=9；JeKo-1，n=4；或 RAMOS，n=4 细胞（E:T（效应物：目标物）比率 5:1），在半胱天冬酶抑制剂 QVD 存在下用指定浓度的 selinexor 或 DMSO 对照预处理 16 小时。然后在紫色染料染色的靶细胞上使用碘化丙啶染色评估细胞毒性。显示的是 A) 中 RAMOS 靶细胞的代表性示例和 B) 中以碘化丙啶 + 靶细胞百分比表示的数据。N 数字表示独立的 NK 细胞供体。数据采用配对单向方差分析，然后是 Dunnett 的事后检验分析：*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.005。(C)在半胱天冬酶抑制剂 QVD 存在下，将 SUDHL4、JeKo-1 和 RAMOS 细胞与指定浓度的 selinexor 或 DMSO 对照孵育 16 小时。然后通过免疫印迹检测 XPO1 和 β-肌动蛋白水平。两个独立实验的代表。(D, E)将健康人 PBMC 与 IL-15 孵育过夜，然后与 SUDHL4 (n=6)、JeKo-1 (n=12) 和 RAMOS (n=) 共培养 (E:T 5:1) 4 小时7) 用指定浓度的 selinexor 或 DMSO 对照预处理细胞 16 小时。然后在 CD56^dim和 CD56 Bright 上评估脱粒 (^{CD107a )}如代表性示例中所示鉴定的 NK 细胞。(D)中显示了 PBMC 与 selinexor 处理的 SUDHL4 共培养后增强 NK 细胞脱粒的代表性示例。标准化为“无目标”对照的 CD107a 显示在(E)中。使用重复测量单向方差分析和 Dunnett 的事后检验分析对组进行分析：*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.005。

Selinexor 下调肿瘤细胞表面 HLA-E 表达并选择性激活 NKG2A+ NK 细胞
NK 细胞活性受到大量激活和抑制受体的严格控制，这些受体识别和接合在受感染、转化或受压的靶细胞表面膜上表达的配体。因此，为了研究 selinexor 与淋巴瘤细胞孵育后增强 NK 细胞活化和杀伤的机制，我们通过流式细胞术筛选了 SUDHL4、JeKo-1 和 RAMOS 细胞，以了解用于激活和抑制 NK 细胞受体的一组配体的变化。selinexor 孵育 16 小时 (50-2000nM) 后，激活配体 Vimentin 和 ULBP-2/5/6 的表达没有明显变化，ULBP-1 有下调趋势，云母/B、B7-H6 和 ICAM1（图 2A）。来自这些活化受体的信号不能解释在 selinexor 预处理淋巴瘤细胞后注意到的 NK 细胞活化增加（图 1）。因此，我们评估了抑制性 NK 细胞受体的配体表达。由 HLA-E 特异性抗体 3D12 测定的 HLA-E 的表面表达在 SUDHL4（减少 57%，p<0.001）、JeKo-1（减少 19%，p<0.01）和 RAMOS（63%）上被 selinexor 下调以浓度依赖性方式减少，p<0.001) 细胞（图 2B，C）。这不是由于细胞大小减小，因为在 selinexor 治疗后前向散射没有变化（图 2B，C）。此外，通过抗体克隆 W6/32 测量，selinexor 导致总 HLA 分子的下调低得多但具有统计学意义（图 2B、C）。这种降低可能对应于 HLA-E 的下调，因为 W6/32 抗体克隆除了识别 HLA-E 之外，还识别 HLA 蛋白 HLA-A、-B、-C。与该模型一致，HLA-E 代表细胞表面总 HLA 的相对较小部分。然后，我们使用来自 CLL 患者的样本评估了 selinexor 是否调节了原发性肿瘤细胞上 HLA-E 的表达。Selinexor 降低了所有四个测试患者样本中 CD5+CD19+ CLL 细胞的表面 HLA-E 表达，体外40 小时后在 2000nM 时平均降低 49%孵育（图 2D，p<0.005）。然后，我们讨论了 selinexor 的表面 HLA-E 下调是否对恶性 B 细胞具有特异性，或者 selinexor 是否也调节来自健康供体的淋巴细胞上 HLA-E 的表达。与正常 T 细胞 (p<0.0001) 和 NK 细胞 p<0.0001 相比，selinexor (500-2000nM) 与健康供体 PBMC 一起孵育 16 小时导致正常 B 细胞表面 HLA-E 表达显着下调（图 2E ） ）。该数据表明，相对于其他淋巴细胞群，XPO1 抑制诱导恶性 B 细胞以及正常 B 细胞表面 HLA-E 表达的丧失。Selinexor 没有降低 SUDHL4 淋巴瘤细胞中 HLA-E 的总蛋白水平（图 2F，G)，因此 XPO1 介导的表面 HLA-E 下调不是由于靶向抑制 HLA-E 蛋白的产生，而是更可能是由于其他 HLA-E 结合底物供应减少导致 HLA-E 上调。事实上，与其他 HLA 分子相比，HLA-E 的表面表达对阻断新合成的蛋白质转运高度敏感，并且 selinexor 有效抑制蛋白质翻译。

图 2 Selinexor 降低恶性 B 细胞上 HLA-E 的表面表达(A)在半胱天冬酶抑制剂 QVD 存在下，将 SUDHL4 细胞与指定浓度的 selinexor 或 DMSO 对照孵育 16 小时，然后评估波形蛋白、ULBP-1、ULBP-2/5/6、MICA/B、B7 的表面表达-H6 和 ICAM1 通过流式细胞术。从三个独立实验中显示了代表性数据和作为控制百分比的汇总数据。（乙，丙）SUDHL4、JeKo-1 和 RAMOS 细胞与指定浓度的 selinexor 或 DMSO 对照在半胱天冬酶抑制剂 QVD 存在下孵育 16 小时，然后评估 HLA-E（克隆 3D12）、I 类 HLA 蛋白（泛-HLA，克隆 W6/32) 和由 FSC-A 参数测量的细胞大小。SUDHL4 细胞的代表性直方图显示在(B)中，SUDHL4 (n=8)、JeKo-1 (n=5) 和 RAMOS (n=3) 细胞的汇总数据平均值 ± SEM 显示在(C)中。使用单因素方差分析和 Dunnett 的事后检验分析对数据进行分析：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.005，****P < 0.0001。(四)在半胱天冬酶抑制剂 QVD 存在下，将原代 CLL 细胞与指定浓度的 selinexor 或 DMSO 对照孵育 40 小时，然后评估 CD5+CD19+CLL 细胞的 HLA-E 表面表达（克隆 3D12）。显示的是来自四个不同 CLL 患者样本的 DMSO 对照的 HLA-E %。使用单因素 ANOVA 分析数据，然后使用 Dunnett 的事后检验分析：*P < 0.05，***P < 0.005。(E)将健康人 PBMC 与 selinexor (500-2000nM) 或 DMSO 对照孵育 16 小时，然后评估 HLA-E (克隆 3D12) 在 B 细胞、T 细胞和 NK 细胞群上的表面表达。作为对照的 HLA-E % 的汇总数据显示来自六个不同的供体。使用双向 ANOVA 分析数据：****P < 0.0001。（女，女）在半胱天冬酶抑制剂 QVD 存在下，将 SUDHL4 细胞与指定浓度的 selinexor 或 DMSO 对照孵育 16 小时。然后通过免疫印迹检测 HLA-E 和 β-肌动蛋白水平。代表性图像显示在(F)中，汇总数据平均值 ± SD 蛋白带强度相对于 β-肌动蛋白 (n=2) 显示在(G)中。

综合这些数据表明，selinexor 下调淋巴瘤细胞系（SUDHL4、JeKo-1 和 RAMOS）和原代 CLL 细胞上的 HLA-E 表面表达。HLA-E 是抑制性受体 NKG2A 的配体，这表明它可能增加 NK 细胞活性的潜在机制 。因此，我们假设 selinexor 会选择性地激活 NKG2A+ NK 细胞对抗淋巴瘤细胞。实际上，通过 CD107a 表达和 IFNγ 产生测量，selinexor 诱导 NKG2A+ 而不是 NKG2A-NK 细胞对 SUDHL4 细胞的激活（图 3）。如前所述（39)，与 NKG2A-NK 细胞相比，NKG2A+ NK 细胞在没有 selinexor 的情况下显示针对靶细胞的 CD107a 和 IFNγ 表达增强，但是通过添加 selinexor，这种激活在 NKG2A+ 细胞中进一步增强（图 3）。我们注意到在没有 selinexor 的情况下，供体 CD107a 和 IFNγ 表达之间存在显着基线差异，如前所述，但是 selinexor 治疗增加了所有测试供体的 CD107a，以及所测试的六个供体中的三个的总体 IFNγ (图 3B )。这些数据证实，selinexor 通过下调表面 HLA-E 增加 NK 细胞对淋巴瘤细胞的活化，减少这种抑制性受体的参与并促进 NKG2A+ NK 细胞的活化。

图 3 NKG2A+ NK 细胞被 selinexor 选择性激活(A, B)健康人 PBMC 与 IL-15 一起孵育过夜，然后与 SUDHL4 细胞共培养 (E:T 5:1) 4 小时，SUDHL4 细胞用指定浓度的 selinexor 或 DMSO 对照预处理 16 小时。然后在 NKG2A+ 和 NKG2A-CD3-CD56+ NK 细胞上评估脱粒（CD107a，n=10）和 IFNγ 产生（n=6），如代表性实施例 A）所示。PBMCs 与 selinexor 处理的 SUDHL4 共培养后 CD107a 和 IFNγ 染色的代表性示例显示在(A)中。归一化为“无目标”对照的 CD107a 和 IFNγ 显示在(B)中。使用重复测量单向方差分析和 Dunnett 的事后分析对组进行分析检验分析：*P < 0.05；**P < 0.01；ns，不显着。

NKG2A+ NK 细胞的激活需要 XPO1 抑制而不是降解
为了确认 XPO1 是 selinexor 诱导的 HLA-E 下调的靶标，我们使用了另一种 XPO1 抑制剂细霉素 B。这是一种来自链霉菌的代谢物，可有效抑制 XPO1 功能但不会诱导 XPO1 降解 。与细霉素 B (50nM) 一起孵育的 SUDHL4 细胞显示出表面 HLA-E 表达显着降低，这与 selinexor 介导的情况相似（图 4A）。如前向散射测量所揭示的，HLA-E 表达减少不是由细胞大小的变化引起的（图 4B）。据此，与细霉素 B 一起孵育的 SUDHL4 细胞显着增加了 NKG2A+ 而非 NKG2A- NK 细胞的活化，如通过 CD107a 表达测量的（图 4C、D）。然后，我们使用免疫印迹证实，与之前报道的 selinexor（图 4E ）相比，细霉素 B 不会降低 XPO1 蛋白水平。然而，细霉素 B 确实增加了 p53 的表达，这与之前的报道一致。此外，通过不存在切割的 PARP (cPARP) 证实了 QVD 对细霉素 B 诱导的细胞凋亡的阻断（图 4E）。该数据表明，在没有降解的情况下，抑制 XPO1 足以使 HLA-E 下调肿瘤细胞并导致 NKG2A+ NK 细胞活化。

图 4增强的 NK 细胞活化取决于淋巴瘤细胞中的 XPO1 抑制，而不是降解(A, B)在半胱天冬酶抑制剂 QVD 存在下，将 SUDHL4 细胞与细霉素 B (LMB) (50 nM)、selinexor ((Sel) 2000 nM) 或 DMSO 对照孵育 16 小时，然后评估 HLA-E 的表面表达（克隆 3D12）和由 FSC-A 参数测量的细胞大小。显示 HLA-E (A)和 FSC-A(B)的汇总数据平均值 ± SEM。使用单因素 ANOVA 分析数据，然后使用 Dunnett 的事后检验分析：****P < 0.0001。(C, D)健康人 PBMC 与 IL-15 孵育过夜，然后与 SUDHL4 (n=5) 共培养 (E:T 5:1) 4 小时，细胞在存在下用细霉素 B (50nM) 或 DMSO 对照预处理 16 小时半胱天冬酶抑制剂 QVD。然后在 NKG2A+ 和 NKG2A-CD3-CD56+ NK 细胞上评估脱粒 (CD107a)，如代表性实施例(C)所示。(C)中显示了 PBMC 与经细霉素 B 处理的 SUDHL4 细胞共培养后 CD107a 染色的代表性示例。(D)中显示了标准化为“无目标”对照的 CD107a。用配对 t 检验分析组：* P < 0.05。(五)在半胱天冬酶抑制剂 QVD 存在下，将 SUDHL4 细胞与指定浓度的 selinexor、细霉素 B (LMB, 50 nM) 或 DMSO 对照孵育 16 小时。然后通过免疫印迹检测 HLA-E、PARP、p53 和 β-肌动蛋白水平。代表性图像来自两个独立的实验。ns，不显着。

Selinexor 与抗 CD20 单克隆抗体联合增强 ADCC
通过 Fc γ 受体 CD16 (FcgRIIIA) 的表达，NK 细胞可以在淋巴瘤的抗 CD20 单克隆抗体 (mAb) 治疗期间引发抗肿瘤功能。由于目前正在临床评估 selinexor 与抗 CD20 抗体联合用于晚期 B 细胞非霍奇金淋巴瘤患者 (NCT03147885)，我们讨论了 selinexor 是否可以增强抗 CD20 mAb 利妥昔单抗和 obinutuzumab 的活性。SUDHL4 细胞与 selinexor (50-2000nM) 一起孵育 16 小时，然后与利妥昔单抗、obinutuzumab 或同种型对照一起培养 20 分钟，然后加入含有 NK 细胞的健康供体 PBMC。NKG2A+ 和 NKG2A- NK 细胞脱粒 NK 细胞群通过添加利妥昔单抗或 obinutuzumab 增加（图 5A) 并且根据我们之前的数据，在 NKG2A+ 而不是 NKG2A-NK 细胞群中，selinexor 进一步增加了这种激活（图 5A）。该数据表明 selinexor 在两种不同的临床相关抗 CD20 抗体存在的情况下增强 NK 细胞活化。为了证实这导致淋巴瘤细胞溶解增加，我们用分离的 NK 细胞进行了细胞毒性测定。在同种型对照、利妥昔单抗和 obinutuzumab 存在下，selinexor (500nM) 显着增加了针对 SUDHL4 细胞的 NK 细胞特异性细胞毒性（图 5B）。总之，selinexor 与抗 CD20 抗体组合可增强针对淋巴瘤细胞的 ADCC。

图 5NKG2A+ NK 细胞的 ADCC 被 selinexor 增强(A) 将健康人 PBMC 与 IL-15 孵育过夜，然后与用 selinexor (500nM) 或 DMSO 对照预处理 16 小时的 SUDHL4 细胞共培养 (E:T 5:1) 4 小时。在与 PBMC 共培养前 20 分钟，将 SUDHL4 与 1 µg/mL 的利妥昔单抗 (rit)、obinutuzumab (obz) 或同种型对照一起孵育。然后在 NKG2A+ 和 NKG2A-CD3-CD56+ NK 细胞 (n=6) 上评估脱粒 (CD107a)。CD107a 被归一化为“无目标”对照，并用配对 t 检验分析每种抗体治疗的 selinexor 浓度之间的 CD107a 阳性：* P < 0.05；**P < 0.01。(乙)用 IL-15 孵育过夜的分离 NK 细胞与 SUDHL4 细胞 (E:T 5:1) 共培养 4 小时，SUDHL4 细胞 (E:T 5:1) 在半胱天冬酶抑制剂存在下用 selinexor (500 nM) 或 DMSO 对照预处理 16 小时QVD。在与分离的 NK 细胞共培养 20 分钟前，将 SUDHL4 与 1 µg/mL 的利妥昔单抗 (rit)、obinutuzumab (obz) 或同种型对照一起孵育。然后在紫色染料染色的靶细胞上使用碘化丙啶染色评估细胞毒性。将数据 (n=6) 标准化为相应的“无 NK + 抗体”对照并用配对 t 检验进行分析：*P < 0.05；**P < 0.01；ns，不显着。

NK细胞功能障碍在人类癌症中经常发生，克服这一点的治疗策略对于持续的肿瘤消退很重要。我们的数据表明，选择性 XPO1 抑制剂 selinexor 会破坏抑制性 NKG2A:HLA-E 轴，从而激活 NK 细胞对抗癌症。NKG2A 是一种新型免疫检查点靶点，针对 NKG2A 的阻断抗体目前处于 3 期临床试验中。Selinexor通过下调肿瘤细胞表面的配体 HLA-E 来阻断 NKG2A 介导的抑制活性。因此，这项研究表明，selinexor通过以下方式刺激抗癌反应除了已知的直接细胞毒活性外，还可以激活免疫系统。
NKG2A 是一种含有抑制性受体的 ITIM，由 NK 细胞和 T 细胞表达，它与靶细胞表面膜上的 HLA-E 结合。NKG2A 的连接导致酪氨酸磷酸酶 SHP-1 的募集以及随后抑制 NK 和 T 细胞效应功能。因此，selinexor 下调淋巴瘤细胞上的 HLA-E 会消除这种抑制信号，并导致 NK 细胞的细胞因子产生和细胞毒性增强。我们没有看到 selinexor 诱导 HLA-E 蛋白降解的证据，因为总 HLA-E 蛋白水平保持不变。相反，selinexor 导致表面膜上 HLA-E 表达的选择性降低。表面膜上的 HLA-E 稳定需要不断地从 ER 转运新合成的分子，这与其他 HLA 分子形成对比，后者在新分子转运受阻时在表面膜上更稳定。XPO1 将核糖体亚基从细胞核转运到细胞质，据此，selinexor 在 XPO1 表达上调的肿瘤细胞中选择性地抑制蛋白质翻译。先前已证明破坏恒定的从头蛋白质合成可选择性下调 HLA-E 表面表达，因此这为 selinexor 和细霉素 B 对淋巴瘤细胞的选择性 HLA-E 下调提供了潜在机制。有趣的是，HLA-E 具有硼替佐米通过ER 应激在多发性骨髓瘤和 CDK 抑制剂 dinaciclib 在 AML 中也显示下调。
HLA-E 经常在实体瘤和血液恶性肿瘤中过度表达，包括 CLL 和多发性骨髓瘤。因此，selinexor 介导的 HLA-E 下调可能与激活 NK 细胞对抗实体瘤和多发性骨髓瘤以及淋巴瘤具有广泛的相关性。事实上，抗体介导的 NKG2A:HLA-E 相互作用阻断已被证明可在体外和体内激活 NK 细胞对抗淋巴瘤和实体瘤细胞和阻断性抗 NKG2A 抗体 monolizumab 目前正处于与抗 EGFR 抗体西妥昔单抗 (NCT04590963) 联合治疗头颈癌的 3 期临床试验中。此外，NKG2A 阻断剂与抗 PD-1 抗体协同作用以增强肿瘤消退并与西妥昔单抗联合促进 ADCC。这些组合策略突出了本研究结果的效用，表明 selinexor 增强了针对涂有 obinutuzumab 和 rituximab 的淋巴瘤细胞的 ADCC。Selinexor 目前正在与抗 CD20 抗体联合用于晚期 B 细胞非霍奇金淋巴瘤（NCT03147885）患者的临床试验中进行评估，因此 selinexor 对 HLA-E 的下调可能有助于这种情况下的 ADCC。最近的一项研究发现，HLA-E 抑制 NK 细胞对肿瘤细胞的敏感性，并且多项临床研究中对免疫检查点阻断治疗的抵抗与 NK 敏感性基因特征相关，包括 HLA-E 。该数据表明，可以刺激 NK 激活的疗法，例如通过破坏 NKG2A:HLA-E 相互作用，可以克服免疫检查点阻断抗性。Selinexor 目前正在与抗 CTLA-4 和抗 PD-1 抗体 (NCT04850755) 联合进行临床试验，因此有必要评估 NK 细胞在这种情况下对疗效的贡献。重要的是，在 selinexor 治疗期间，患者可实现下调 HLA-E 所需的 selinexor 浓度，临床试验期间报告的患者血浆中的 Cmax 为 1-2µM。
因为 XPO1 在肿瘤中上调，而 selinexor 选择性地阻断肿瘤细胞中的翻译，通过selinexor 而不是抗体阻断 NKG2A:HLA-E 相互作用的潜在优势是 selinexor 可以保留 HLA-E 在非肿瘤细胞上的表达。这很重要，因为 NKG2A:HLA-E 相互作用对于 NK 细胞培养和预防健康细胞裂解至关重要 。Selinexor 在恶性和正常 B 细胞上的 HLA-E 表达比在正常 T 细胞或 NK 细胞上的下调程度更大。此外，在接受 selinexor 治疗的患者中未观察到自身免疫副作用，这表明 selinexor 不会促进 NK 细胞定向杀伤非恶性细胞。
在小鼠模型中，selinexor 增加了 T 细胞和 NK 细胞的频率，但其机制尚不清楚。然而，该数据意味着 XPO1 抑制可能在促进 NK 活性方面具有双重作用，即通过使肿瘤对 NK 介导的破坏敏感并同时增加 NK 细胞频率。此外，我们发现 selinexor 增加了 NK 细胞产生的 IFNγ。这很重要，因为 IFNγ 在促进适应性免疫、刺激巨噬细胞活化和抗体依赖性细胞吞噬作用 (ADCP) 以及抑制肝转移方面具有关键作用）。重要的是，XPO1 抑制不会显着影响人类 NK 细胞介导的 ADCC、直接细胞毒性或活力。此外，selinexor在体内小鼠肿瘤模型中增加了 NK 细胞频率。总之，这表明本研究的结果可能与体内相关，其中靶细胞和 NK 细胞将同时暴露于 selinexor。除了 NK 细胞，抑制 NKG2A 也被证明可以通过CD8+ T 细胞激活增强癌症疫苗在小鼠肿瘤模型中的功效，因此 selinexor 介导的 HLA-E 下调也可能促进 T 细胞活性。有趣的是，先前的研究表明，selinexor 预处理增加了针对 B 细胞恶性肿瘤 和乳腺癌细胞的 T 细胞活化，但未研究 HLA-E/NKG2A 相互作用在这些环境中的贡献。根据我们的数据，这可能是由于 selinexor 破坏了 NKG2A:HLA-E 轴，这似乎是合理的。
除了在肿瘤中的作用外，XPO1 对 COVID-19 感染也至关重要，最近显示 selinexor 可抑制 COVID-19 介导的病理学和中性粒细胞性鼻炎。NKG2A:HLA-E 相互作用在该模型中的作用没有被研究，但有趣的是，抑制 NKG2A 会增加 IFNγ 介导的中性粒细胞抑制。抗体介导的 NKG2A 阻断已被提议作为一种新的 COVID-19 治疗，因此 selinexor 介导的 HLA-E 下调也可能参与 selinexor 的抗病毒功效。
总之，我们通过HLA-E 下调和由此产生的 NKG2A+ NK 细胞活化确定了 XPO1 抑制剂的新抗肿瘤机制。该数据表明 NK 细胞可能有助于 selinexor 的治疗效果，并且 selinexor 可能与 NK 细胞靶向疗法协同治疗癌症患者。目前正在研究 NK 细胞是否与 selinexor 治疗后的患者预后相关。
参考链接：Selinexor Enhances NK Cell Activation Against Malignant B Cells via Downregulation of HLA-E https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2021.785635/full#h4